מיקרוסקופ פלואורסצנטי ברזולוציה גבוהה 17.10.2014

כדי לראות את התא ואת תוכנו, עלינו לקחת מיקרוסקופ. עקרון הפעולה שלו פשוט יחסית: קרני אור עוברות דרך עצם ואז נכנסות לעדשות מגדילות, כך שנוכל לראות גם את התא וגם חלק מהאברונים שבתוכו, כמו הגרעין או המיטוכונדריה.

אבל אם אנחנו רוצים לראות חלבון או מולקולת DNA, או להסתכל על קומפלקס על-מולקולרי גדול כמו ריבוזום, או חלקיק וירוס, אז מיקרוסקופ אור רגיל יהיה חסר תועלת. עוד ב-1873, הפיזיקאי הגרמני ארנסט אבה הסיק נוסחה שמציבה גבול ליכולותיו של כל מיקרוסקופ אור: מתברר שאי אפשר לראות עצם הקטן ממחצית אורך הגל של האור הנראה - כלומר פחות מ-0,2 מיקרומטרים.

הפתרון, כמובן, הוא לבחור במשהו שיכול להחליף את האור הנראה. אתה יכול להשתמש בקרן אלקטרונים, ואז נקבל מיקרוסקופ אלקטרונים - אתה יכול לצפות בו וירוסים ומולקולות חלבון, אבל העצמים הנצפים במהלך מיקרוסקופ אלקטרונים נכנסים לתנאים לא טבעיים לחלוטין. לכן, הרעיון של Stefan W. Hell מהמכון לכימיה ביו-פיזיקלית של אגודת מקס פלאנק (גרמניה) התברר כמוצלח ביותר.

מהות הרעיון הייתה שניתן להקרין עצם באמצעות קרן לייזר, שתכניס מולקולות ביולוגיות למצב נרגש. ממצב זה הם יתחילו לנוע למצב הנורמלי, וישחררו את עצמם מעודף אנרגיה בצורה של קרינת אור – כלומר תתחיל הקרינה, והמולקולות ייראו. אבל הגלים הנפלטים יהיו באורכים שונים מאוד, ולנגד עינינו תהיה לנו נקודה בלתי מוגדרת. כדי למנוע זאת, יחד עם לייזר עירור, האובייקט מטופל באמצעות קרן מרווה, המדכאת את כל הגלים מלבד אלו שאורכם ננומטרי. קרינה באורך גל בסדר גודל של ננומטר רק מאפשרת להבחין בין מולקולה אחת לאחרת.

השיטה נקראה STED (דלדול פליטה מעורר), ועל כך קיבל סטפן הל את חלקו בפרס נובל. במיקרוסקופ STED, האובייקט אינו מכוסה לחלוטין על ידי עירור לייזר בבת אחת, אלא נמשך, כביכול, על ידי שתי קרניים דקות של קרניים (מעורר ומרווה), מכיוון שככל שהשטח שפורר בזמן נתון קטן יותר, כך גבוה יותר. רזולוציית התמונה.

שיטת STED נוספה לאחר מכן על ידי מה שנקרא מיקרוסקופיה של מולקולה בודדת, שפותחה באופן עצמאי בסוף המאה ה-XNUMX על ידי שני זוכי פרס נוכחיים נוספים, אריק בציג ממכון הווארד יוז וויליאם אי. מורנר מסטנפורד. ברוב השיטות הפיזיקוכימיות המסתמכות על הקרינה, אנו רואים את הקרינה הכוללת של מולקולות רבות בבת אחת. וויליאם מרנר בדיוק הציע שיטה שבאמצעותה ניתן לצפות בקרינה של מולקולה בודדת. תוך כדי ניסוי עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), הוא שם לב שניתן להפעיל ולכבות את הזוהר של המולקולות שלו באופן שרירותי על ידי מניפולציה של אורך גל העירור. על ידי הפעלה וכיבוי של הקרינה של מולקולות GFP שונות, ניתן היה לצפות בהן במיקרוסקופ אור, תוך התעלמות מהמגבלה הננומטרית של Abbe. ניתן היה להשיג את כל התמונה על ידי שילוב של מספר תמונות עם מולקולות זוהרות שונות בשדה הראייה. לנתונים אלו הוסיפו רעיונותיו של אריק בציג, שהציע להגביר את הרזולוציה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי על ידי שימוש בחלבונים בעלי תכונות אופטיות שונות (כלומר, באופן גס, רב צבעים).

השילוב של שיטת כיבוי-העירור של Hell's עם שיטת הטלת הסכום של Betzig-Merner איפשר לפתח מיקרוסקופיה ברזולוציה ננומטרית. בעזרתו, אנו יכולים לצפות לא רק באברונים ושבריהם, אלא גם באינטראקציות של מולקולות זו עם זו (אם המולקולות מסומנות בחלבונים פלואורסצנטיים), אשר, אנו חוזרים, רחוקים מלהיות אפשרי תמיד בשיטות של מיקרוסקופ אלקטרונים. בקושי ניתן להפריז בערכה של השיטה, כי מגעים בין-מולקולריים הם מה שעומדת עליו הביולוגיה המולקולרית ובלעדיהם אי אפשר, למשל, לא יצירת תרופות חדשות, לא פענוח של מנגנונים גנטיים, ולא הרבה דברים אחרים הטמונים ב תחום המדע והטכנולוגיה המודרניים.